意义：红外神经刺激（INS）利用脉冲红外光，在无需外源性化合物的情况下选择性诱发神经活动。尽管该技术在众多生物医学应用中具备广泛适用性，但现有文献尚未对波长、辐照量、光斑尺寸等与红外神经刺激有效性及安全性相关的因素开展全面对比研究。
目的：本研究采用红外神经刺激常用的三种波长（1450nm、1875nm、2120nm）对上述参数进行评估。
方法：在在体大鼠坐骨神经模型中，以刺激阈值与激活概率达到 100% 的转换速率为指标，对比各参数的刺激效果。
结果：1450nm 与 1875nm 脉冲二极管激光器的刺激阈值（约 1.0J/cm∧（2））始终高于 2120nm 钬钇铝石榴石激光器（约 0.7J/cm∧（2））。此外，钬钇铝石榴石激光器激活概率达到 100% 的转换速率快于二极管激光器。实验数据表明，钬钇铝石榴石激光器的优异性能源于脉冲起始阶段的高强度微秒尖峰。对二极管激光辐照神经的急性组织学评估，明确了安全的刺激辐照量范围。
结论：综上，本研究结果提出了可提升红外神经刺激技术安全性、有效性及易用性的优化方案，为该技术的科研与临床应用提供依据。
一、引言
展开剩余96%近一个世纪以来，科研人员与临床工作者一直通过直接施加电流来调控神经活动，探究神经系统的结构与功能。时至今日，电刺激仍是评估与量化神经活动的金标准。电刺激虽应用广泛，却存在固有缺陷，即电流扩散与刺激伪迹。电流扩散指注入电流向周围组织弥散，会限制神经激活的空间特异性。在靶向神经特定区域或大脑、耳蜗等空间依赖性较高的神经结构时，空间特异性在临床与实验研究中均具有重要价值。临床中，脑深部刺激时的电流扩散会引发有害副作用，影响帕金森病的有效治疗。在外周神经系统中，电流扩散可直接诱发肌肉收缩，导致受损神经节段的神经活性判断出现假阳性结果。提升空间特异性、克服电流扩散，需要精准控制电极位置，或采用膜片钳技术等方式实现神经元直接电耦合。除电流扩散外，刺激伪迹会掩盖真实的电生理信号，阻碍刺激位点近端的信号记录，还会影响神经移植物活性判断与术中神经监测时电生理记录结果的解读。因此，能实现空间局限式激活且无刺激伪迹的神经刺激技术，是临床与实验领域亟需的研究工具。
首批关于红外神经刺激（INS）的研究，以及光遗传学领域的奠基性研究均证实，可通过光学方式刺激特异性神经元群，且不会产生刺激伪迹或组织接触损伤。光遗传学需对神经组织进行基因修饰以表达光敏离子通道，而红外神经刺激则通过组织吸收短波红外（SWIR）光直接诱发神经活动。此外，红外神经刺激固有的空间精准性，源于其快速产生的时空温度梯度。红外脉冲产生的热能，会根据激光光斑尺寸与光在组织中的穿透深度，局限于辐照区域内。研究人员进一步揭示了热能沉积诱发动作电位的机制。
在红外神经刺激（INS）过程中，水分吸收引发的瞬时热效应会使细胞膜电容发生快速改变，进而诱发动作电位。在后续研究中，研究人员发现，热机械效应会导致细胞膜沿轴向变薄、横向扩张，从而引起细胞膜电容变化。尽管研究人员对具体机制仍存在争议，但这种电容改变似乎是通过细胞外磷脂双分子层内的热机械效应触发的通用机制来诱发动作电位。虽然目前对红外神经刺激的生物物理机制尚未完全阐明，但该技术无需标记的固有特性以及高度的空间特异性，使其非常适合临床转化应用。
此前，研究人员已通过在人体背根丝中激活特定功能连接，证实了红外神经刺激应用于人体的可行性，且其精准度优于电刺激。在中枢神经系统中，研究人员已将红外神经刺激用于非人灵长类动物视觉系统的皮层定位，以及调控任务特异性行为。在动物模型中，红外神经刺激可用于前列腺、膀胱及颅底等部位的手术导航，以最大限度减少神经附带损伤，分别降低尿失禁、勃起功能障碍及面瘫等并发症的发生风险。综上，这些研究证实，红外神经刺激在中枢和外周神经系统中均具有潜在的重要临床应用价值。
尽管红外神经刺激已被证实具备临床应用价值，但用于该技术的激光系统成本高昂、体积庞大，成为其广泛应用的主要障碍。早期红外神经刺激研究所使用的闪光灯泵浦固态激光器体积大且价格昂贵。随着该领域的发展，成本更低的二极管激光系统在相关实验室中得到了更广泛的应用。多个研究团队利用这类低成本二极管系统，证实了 1875nm 和 1450nm 波长激光诱发神经活动的有效性。定制化二极管系统造价可低至数千美元，但需要使用者具备一定的激光硬件与电子电路操作能力。其他研究团队则选择使用光纤激光器，其中以中心波长约 2000nm 的可调谐铥光纤激光器最为常用，但该波长激光在组织中的水分吸收可能过强。许多研究团队自行搭建定制化激光系统开展红外神经刺激研究，这也是导致现有文献中实验参数存在较大差异的主要原因。为使红外神经刺激成为一种易用且可靠的临床神经调控工具，亟需对可实现安全有效刺激的最优激光参数进行评估，包括脉冲宽度、光斑尺寸和辐照量等。此外，尽管已有大量采用 1450nm 激光开展的研究，但目前尚无针对 1450nm 波长红外神经刺激安全性的组织学评估。而在采用 2120nm 钬钇铝石榴石激光器或 1875nm 二极管激光器的急性研究中，未观察到组织学或功能性损伤。研究已确立 2:1 的安全比率，即消融阈值与刺激阈值的比值。鉴于红外神经刺激固有的温度梯度特性，组织学安全性是未来相关实验研究与临床转化工作必须重点考量的关键问题。
本研究旨在对三种短波红外（SWIR）波长激光进行最优刺激参数筛选，包括中心波长 1450nm 和 1875nm 的两种二极管激光器，以及作为 “金标准” 的 2120nm 钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器，通过在体大鼠坐骨神经模型实证评估各波长的刺激效果与组织学安全性。研究考察了光斑尺寸、脉冲宽度和辐照量对红外神经刺激（INS）有效性及安全性的影响。本研究结果提出了最大化二极管激光红外神经刺激效果与安全性的优化策略，同时提升该技术在未来科研与临床应用中的可及性与实用性。
二、材料与方法
所有实验均在范德堡生物光子学中心开展，并严格遵循范德堡动物护理与使用委员会批准的实验方案执行。
2.1. 动物准备
以成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠 (n=26, 300 to 350 g) 作为哺乳动物模型开展在体坐骨神经实验。通过吸入异氟烷 (3%, 3L/min) 动物进行麻醉，并在实验全程维持麻醉状态(2% to 2.5%, 1.5L/min）。麻醉后，将大鼠置于聚碳酸酯实验平台上，佩戴鼻锥以持续维持麻醉状态。实验期间使用水循环加热垫维持动物体温在 36℃至 37℃，并通过直肠探头监测体温。剃除大鼠双侧后肢毛发，将足背固定于平台边缘。自臀肌至腘窝区域在后外侧做一长 3cm 的切口，分离皮肤与下方组织以暴露股二头肌，小心切开肌肉后显露坐骨神经（图 1.）。轻柔去除神经表面覆盖的肌筋膜，保留神经外膜完整。实验全程每隔一段时间用室温无菌生理盐水冲洗神经，以维持组织湿润、防止干燥。实验结束后，按照动物护理与使用委员会批准方案，通过过量麻醉并处以颈椎脱臼法对大鼠实施安乐死。
图1.大鼠坐骨神经在体红外神经刺激（INS）实验装置。激光源直接耦合至多模光纤，将光纤置于神经上方。对神经进行光学刺激，并采用模块化数据采集系统在比目鱼肌记录复合肌肉动作电位（CMAPs）。
2.2. 电生理记录
在比目鱼肌中插入成对的双极皮下针电极，记录复合肌肉动作电位（CMAPs）。在同侧下肢足部插入皮下接地电极。使用 Acknowledge® 软件，通过模块化数据采集系统同步记录复合肌肉动作电位（CMAPs）与激光触发输出信号。复合肌肉动作电位（CMAPs）以 6500Hz 采样，经差分放大器放大后进行数字化采集。所有信号均放大 1000 倍，并进行 0.05～5000Hz 带通滤波。每次实验前，采用标准单极刺激探针通过电刺激 (0.3 to 0.4 V at 500μs) 评估坐骨神经活性。仅将红外脉冲后 5ms 内产生的复合肌肉动作电位（CMAPs）纳入数据分析。典型复合肌肉动作电位（CMAPs）波形见补充材料图 S1.。
2.3. 红外神经刺激
研究共采用四种短波红外（SWIR）波长与三种光斑尺寸，在不同脉冲宽度与辐照量范围内对刺激阈值进行参数评估（表 1.）。实验所用激光器包括两台分别为 1450nm 和 1875nm 的激光二极管系统、一套 1470nm 定制激光二极管系统(Innovative Photonics Solutions, Monmouth Junction, New Jersey)，以及一台 2120nm 钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器。
表 1.红外神经刺激（INS）参数。a 水吸收系数基于研究人员获取数据的三次插值计算得出。b 半高全宽（FWHM）。
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2.3.1. 辐照量与脉冲宽度
在给定光斑尺寸下的所有二极管激光实验中，通过调节二极管电流将辐照量在 0～2.5J/cm∧（2）之间变化。在 1875nm 二极管激光实验中，对给定光斑尺寸调节脉冲宽度以获得所需辐照量（例如，光斑直径500 μm时采用2 ms脉冲，光斑直径1000 μm时采用5 ms脉冲）。对于钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器，通过在光路中放置衰减器调节辐照量。每组实验中，神经以 2Hz 频率接受 10 秒脉冲序列刺激，随机设定辐照量，总计施加 20 个脉冲。
由于 1450nm 和 1875nm 二极管激光器的输出功率有限，本研究采用 1470nm 二极管激光器产生 350μs 脉冲，使其能量与钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器相等。1470nm 二极管激光器仅用于考察脉冲宽度的影响。所有脉冲宽度均指脉冲的半高全宽。
2.3.2. 光斑尺寸
研究测定了三种光斑尺寸对应的刺激阈值：500μm (504.5±20μm)、800μm(805.6±18.8μm) 和 1000μm(1019±29.8μm) （图 2.）。所有光斑尺寸均使用红外光束轮廓仪测量，并通过刀口法验证，数值均为光束轮廓的 1/e² 直径。通过调整直径 400μm 裸光纤输出端与神经表面的距离来改变光斑尺寸。对于 500、800 和 1000μm 的光斑，光纤与神经表面的平均距离分别为 862.9±21.79μm、1874±156μm 和 2646±240μm。使用显微操纵器将光纤探头垂直放置于坐骨神经主干上方。
图2. 采用红外光束轮廓仪测量光斑尺寸，并拟合高斯分布（实线）。为清晰显示，对最大光强进行了调节。 光斑尺寸500＝528.5μm，决定系数R²＝0.9989； 光斑尺寸800＝802.1μm，决定系数R²＝0.9993； 光斑尺寸1000＝1003μm，决定系数R²＝0.9986。
2.3.3. 无尖峰钬钇铝石榴石激光脉冲
为探究钬钇铝石榴石激光脉冲前沿尖峰对红外神经刺激（INS）效果的影响（图 3.（a）），在激光腔外的光路中放置一个 200μm 厚、装有去离子水的玻璃腔以消除尖峰。为获得无尖峰脉冲，逐步提高钬钇铝石榴石激光器的脉冲能量，直至脉冲起始处的微秒尖峰具备足够能量形成蒸汽泡。当尖峰能量产生气泡后，钬钇铝石榴石脉冲中剩余的无尖峰部分可在吸收极少的情况下穿过蒸汽并耦合进入光纤（图 3.（b））。使用连接示波器的铟镓砷放大光电探测器持续监测脉冲时域波形。若某个脉冲未消除尖峰，则该脉冲不纳入数据分析，并增加脉冲序列中的脉冲数量，直至向神经成功施加 20 个无尖峰脉冲。
图3. 钬钇铝石榴石激光器与二极管激光器经曲线下面积（AUC）归一化后的脉冲时域波形。（a）常规钬钇铝石榴石激光与350μs二极管脉冲经曲线下面积（AUC）归一化后的脉冲时域波形。（b）无尖峰钬钇铝石榴石脉冲经曲线下面积（AUC）归一化后的脉冲时域波形。脉冲波形由放大式铟镓砷（InGaAs）探测器采集获得。
2.4. 数据分析
刺激阈值（H₅₀）定义为 50% 的激光脉冲可诱发复合肌肉动作电位（CMAP）响应时的辐照量，本研究采用该定义对所有数据进行比较。为确定刺激阈值，利用每组实验记录计算红外神经刺激（INS）诱发的复合肌肉动作电位（CMAP）数量。需要注意的是，复合肌肉动作电位（CMAP）幅值会随辐照量的增大而升高。本研究以是否出现复合肌肉动作电位（CMAP）作为红外神经刺激成功的生理学判定终点，与其幅值无关，因此诱发复合肌肉动作电位（CMAP）的概率不受幅值影响。峰值幅度高于基线两个标准差以上的响应记为诱发复合肌肉动作电位（CMAP）。将诱发复合肌肉动作电位（CMAP）的次数除以总脉冲数，得到各辐照量对应的激活概率。采用标准正态分布的累积分布函数（CDF）对数据进行拟合，
其中 x 为辐照量，μ 为均值，σ² 为方差，以此确定对应均值 μ 或 50% 诱发概率的辐照量（H₅₀）。尽管 H₅₀在实际应用中参考价值有限，但该方法是测定和比较辐射生物效应剂量阈值的常用手段。H₅₀更低的红外神经刺激（INS）参数有效性更高，因其所需能量更少，产生的温升也更小。
另一个衡量刺激有效性的指标是达到 100% 激活概率的转换速率。达到 100% 激活概率的转换速率定义为拟合累积分布函数（CDF）的峰值斜率（mₚₑₐₖ）。
式中 F′表示 F 的一阶导数。该计算用于表征刺激阈值的确定性。更大的峰值斜率意味着更陡峭的转换速率，对应更可靠、更具可预测性的刺激效果。这一特性更具应用价值，因为仅在较小的辐照量范围内，才会出现无法确定某一脉冲是否诱发动作电位的模糊情况。H₅₀与峰值斜率的计算图示见补充材料图 S2.。
2.5. 组织学评估
选取 12 只大鼠，按照前述手术方案暴露双侧坐骨神经。采用抛光裸光纤，在 500μm 光斑尺寸下，对每条神经上五个不同位点分别施加五种实验条件刺激：三个实验位点、一个阴性对照位点和一个阳性损伤对照位点。所有五个辐照位点沿神经轴向分布，彼此间距 1mm。其余条件均与前述实验方案一致：采用 2Hz 重复频率的 10 秒脉冲序列。每条神经的三个实验位点分别采用 1 倍、2 倍和 3 倍 H₅₀的辐照量进行刺激。约 6.0J/cm∧（2）的辐照量作为阳性损伤对照。阴性对照仅将光纤置于与其他实验组相同位置，不进行辐照。研究采用 1450nm 和 1875nm 激光系统，按照上述实验条件评估神经损伤情况。使用组织学标记染料对每个辐照位点进行标记，以便后续组织切片与制备。刺激结束后立即取出神经，置于 4% 多聚甲醛溶液中固定 48 小时。固定后的样本经石蜡包埋、切片，并用甲苯胺蓝染色，以评估髓鞘损伤情况。组织学切片在 60 倍放大下成像，观察髓鞘结构破坏与空泡化、轴突损伤、消融凹坑形成及炭化等损伤迹象。已有研究采用相同判定标准，系统确定了钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的损伤阈值。
2.6. 统计学分析
所有统计检验均先进行方差分析，再采用邦费罗尼法进行多重比较，以适配小样本量分析。
三、结果3.1. 光斑尺寸
对于各波长激光，H₅₀在所有光斑尺寸下均保持稳定（图 4.）。1450nm 与 1875nm 二极管激光系统的合并平均 H₅₀为 1.01±0.06J/cm∧（2），而钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光在所有光斑尺寸下的平均 H₅₀为 0.73±0.07J/cm∧（2）。1450nm 与 1875nm 二极管激光的刺激效果未观察到显著差异（所有组间比较均满足 p＞0.49）。在所有光斑尺寸下，钬钇铝石榴石激光的 H₅₀均低于二极管激光。该差异在 500μm 光斑尺寸下不显著，但在 800μm（与1450nm和1875nm波长相比，p＜0.02） 与 1000μm（与1450nm和1875nm波长相比，p＜0.014） 光斑尺寸下均具有统计学意义。
图 4.在给定波长下，刺激阈值在各光斑尺寸下均保持恒定，而钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的 H₅₀始终低于两种二极管激光系统。注：1875nm 二极管激光器的输出功率往往低于 1450nm 激光器。因此，1875nm 二极管激光在 500μm、800μm 和 1000μm 光斑尺寸下分别采用 2ms、3ms 和 5ms 脉冲以达到所需辐照量。尽管脉冲宽度有所改变，但 1875nm 波长下的 H₅₀在所有光斑尺寸下均未发生变化。
3.2. 脉冲宽度
由于钬钇铝石榴石激光在 350μs 脉冲条件下的 H₅₀显著低于脉冲宽度≥2ms 的二极管激光，因此研究考察了脉冲宽度对 H₅₀的影响（图 5.）。为对比不同脉冲宽度，采用具备足够输出功率、可在 350μs 脉冲下产生所需辐照量的 1470nm 二极管激光器，探究脉冲宽度对红外神经刺激（INS）效果的作用。此外，1470nm 波长下的水吸收系数（μₐ≈24.9cm∧（-1））与 2120nm 波长（μₐ≈24cm∧（-1））更为接近，优于 1450nm 或 1875nm 波长（表 1.）。在 500μm 光斑尺寸下，脉冲宽度为 2ms 与 350μs 时的 H₅₀无显著变化 [图 5.（a）, p=0.38]。并且，缩短脉冲宽度并不能解释钬钇铝石榴石激光更低的 H₅₀[图 5.（b）]。尽管光斑尺寸与脉冲宽度均相同，钬钇铝石榴石激光的 H₅₀仍显著低于 1470nm 二极管激光(p=0.016)。
图 5.脉冲宽度对 H₅₀的影响。（a）脉冲宽度不会显著改变二极管激光器的 H₅₀。（b）在相同脉冲宽度下，钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的 H₅₀低于二极管激光器。
3.3. 二极管激光与钬钇铝石榴石激光激活概率的转换特征
通过对比激活概率的累积分布函数（CDF），进一步评估不同激光系统下(λ5ms=1875nm,SpotSize5ms=1000μm;λ2ms=1470nm,SpotSize2ms=500μm;λ350μs=1470nm,λ2ms=1470nm,SpotSize350μs=500μm;λHo:YAG=2120nm,SpotSizeHo:YAG=500μm)激活概率的变化规律（图6.）。图6.（a） 展示了基于特定实验条件下所有数据整合得到的累积分布函数。需要说明的是，5ms 脉冲组数据来源于 1875nm 二极管激光实验。由图 5. 可知脉冲宽度不影响 H₅₀，因此不会对本部分结果造成干扰。5ms、2ms 与 350μs 条件下二极管激光系统的整合累积分布函数曲线均较平缓，激活概率逐步向 1 过渡。而钬钇铝石榴石激光的整合累积分布函数分布区间明显更窄，激活概率从 0 到 1 的转换过程更为陡峭。这一陡峭的转换特征体现在各激光器及脉冲宽度对应的峰值斜率中。
图 6.二极管激光器与钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的激活概率差异。（a）在给定参数下，对二极管激光器和钬钇铝石榴石激光器的所有样本拟合累积分布函数（CDF）。（b）不同脉冲宽度下二极管激光器与 350μs 脉冲宽度下钬钇铝石榴石激光器的转换速率（mₚₑₐₖ）。mₚₑₐₖ越大，代表激活概率的转换曲线越陡峭。
激活概率向 1 的转换程度可通过累积分布函数（CDF）的峰值斜率 mₚₑₐₖ 进行量化。mₚₑₐₖ 越大，表明激活概率从 0 到 1 的转换越陡峭，相比 mₚₑₐₖ 较小的激活累积分布函数，其在更窄的辐照量范围内即可快速完成转换。与二极管激光器相比，钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的 mₚₑₐₖ 显著更高 （图 6.（b））。二极管激光器的 mₚₑₐₖ 随脉冲宽度减小而升高，而在相同脉冲宽度下，钬钇铝石榴石激光器的 mₚₑₐₖ 仍高于 1470nm 二极管激光器。
3.4. 钬钇铝石榴石激光脉冲形状对刺激效果的影响
鉴于在相同脉冲宽度和辐照量下，钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器具有更低的 H₅₀和更高的 mₚₑₐₖ，本研究探究了其脉冲时域波形的作用。对比两种激光器的脉冲波形可以发现，非对称钬钇铝石榴石（Ho:YAG）脉冲最显著的特征是脉冲起始处的微秒级尖峰（图3.（a）），这也是闪光灯泵浦型钬钇铝石榴石激光器的典型特征。该微秒尖峰的峰值强度约为二极管激光的 5 倍，因此具备更高的峰值功率。为明确该尖峰是否影响钬钇铝石榴石激光的刺激效果，研究将尖峰从脉冲中去除，并使用无尖峰脉冲重复实验。
去除尖峰后的钬钇铝石榴石（Ho:YAG）脉冲，其 H₅₀ 显著高于未修改的原始钬钇铝石榴石脉冲（p=0.025；图7.（a））。此外，在相同 350μs 脉冲宽度和相同 500μm 光斑尺寸下，无尖峰脉冲的 H₅₀ 与 1470nm 激光的 H₅₀ 无显著差异（p=1）。无尖峰的钬钇铝石榴石脉冲在激活概率上也表现出明显差异。无尖峰脉冲的峰值斜率 mₚₑₐₖ 显著低于常规钬钇铝石榴石脉冲（图7.（c））。在相同脉冲宽度下，无尖峰脉冲的 mₚₑₐₖ 与二极管激光相近。从各组数据拟合的累积分布函数（CDF）中可以直观地看出，无尖峰钬钇铝石榴石脉冲的 mₚₑₐₖ 变化趋势与二极管脉冲趋于一致（图7.（b））。
图7. 无尖峰钬钇铝石榴石（Ho:YAG）脉冲对刺激效果的影响。（a）无尖峰脉冲的H₅₀高于原始钬钇铝石榴石脉冲（H₅₀±标准误，n=5）。（b）无尖峰钬钇铝石榴石激光、原始钬钇铝石榴石激光及二极管激光所有数据的拟合累积分布函数（CDF）。（c）无尖峰钬钇铝石榴石激光、原始钬钇铝石榴石激光及二极管激光的转换速率（mₚₑₐₖ±标准误，n=5）。所有实验条件：光斑尺寸=500μm，二极管波长=1470nm，脉冲宽度=350μs。NS：无尖峰。
3.5. 组织学损伤评估
采用甲苯胺蓝染色评估髓鞘完整性，以此对组织学安全性进行评价。阴性对照组未观察到任何损伤迹象（图8.（a））。在约6 J/cm∧（2）辐照量的阳性对照组中，可清晰观察到组织炭化与玻璃样变性（图8.（b））。1875 nm和1450 nm激光即使在3倍H₅₀阈值的辐照量下，也未出现髓鞘结构破坏或炭化现象（3 J/cm∧（2）；图8.（c）和8.（d））。所有接受1倍、2倍和3倍H₅₀辐照量的样本结果均保持一致。上述结果表明，1875 nm和1450 nm红外神经刺激（INS）的安全比率约为3:1。
图8. 代表性辐照神经切片的甲苯胺蓝染色结果。（a）阴性对照组，未施加刺激。（b）阳性对照组：1450 nm波长、6 J/cm∧（2）辐照。红色椭圆区域为髓鞘损伤部位。（c）1450 nm波长、3.08 J/cm∧（2）辐照。（d）1875 nm波长、3.15 J/cm∧（2）辐照。
四、讨论光学神经调控因其空间选择性，在临床研究与基础研究中均产生了深远影响。在前列腺切除术、脊神经根切断术以及颅底手术等需要高空间分辨率的临床应用中，光学方法可为电刺激提供更优的替代方案。光遗传技术实现选择性神经兴奋需要对基因修饰神经元进行靶向调控，然而，由于未知的免疫反应与潜在的伦理限制，这种基因特异性在人体转化应用中存在诸多困难。红外神经刺激（INS）无需基因修饰或外源性底物即可实现高空间选择性，从而规避了上述局限。因此，红外神经刺激是一种尤其适用于临床转化的方法。本研究旨在确定红外神经刺激发挥最佳效果的优化参数，并验证这些参数不会造成组织损伤风险。结果表明，缩短脉冲宽度可提升激活概率，且二极管激光器的安全比率约为 3:1，与光斑尺寸无关。
1450nm 和 1875nm 二极管激光器在所有考察的光斑尺寸下，H₅₀ 均稳定在约 1 J/cm∧(2)（图 4.）。因此，扩大光斑尺寸的主要代价是牺牲红外神经刺激（INS）固有的空间选择性。由于水是短波红外（SWIR）波段内为红外神经刺激提供所需热量的主要吸光基团，我们最初预期水吸收系数更高的 1450nm 会比 1875nm 具有更低的 H₅₀。此外，在短波红外波段，散射可忽略不计，因为吸收系数远大于有效散射系数。然而，当对由下式给出的源项 S (z) 进行分析时
该式以 J/cm³ 为单位描述特定深度下的吸收能量密度，其中 H₀为初始辐照量，z 为激光在组织中的穿透深度。将这两个波长结合大鼠坐骨神经解剖结构进行对比后发现，各波长在神经束内部沉积的能量基本相等（补充材料图 S3）。由于吸收能量是热量产生乃至红外神经刺激（INS）的根本驱动力，因此这一对比结果比相对吸收系数更具实际意义。
此外，本研究用于判定刺激成功的终点指标为复合肌肉动作电位（CMAP），它是兴奋轴突群体产生的次级综合响应。因此，复合肌肉动作电位并不依赖某一特定深度单个轴突的激活，而是取决于整个辐照区域内多个轴突的激活。本研究中三种二极管激光器的 H₅₀相近，原因可能是它们在神经束内部沉积的能量相近。而钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的 H₅₀约为 0.7J/cm∧（2），低于二极管激光器，且这一规律在所有光斑尺寸下均保持一致。在 800μm 和 1000μm 光斑尺寸下，二极管激光器与钬钇铝石榴石激光器之间的 H₅₀差异具有统计学意义（所有组间比较均 p＜0.02）。不过，乍看之下，这一差异似乎与研究人员此前的观测结果相矛盾。
研究人员在相同的大鼠坐骨神经在体模型中，并未观察到二极管激光器与钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器之间存在同样的刺激阈值差异。两种激光器的刺激阈值均稳定在 0.4～0.5J/cm∧（2）之间。但不同研究报道数值的差异，源于命名方式与辐照量计算方法的不同。本研究中刺激阈值指 H₅₀，即 50% 脉冲可诱发复合肌肉动作电位（CMAP）时的辐照量；而研究人员将刺激阈值定义为可诱发复合肌肉动作电位的最低辐照量。因此，本研究的 H₅₀理应高于研究人员报道的刺激阈值。若采用研究人员的刺激阈值定义与光斑尺寸计算方法，本研究数据可得到相近结果：钬钇铝石榴石激光器与 2ms 脉冲的 1875nm 二极管激光器的刺激阈值分别为 0.32J/cm∧（2）和 0.39J/cm∧（2）。此外，本研究采用刀口法测量光斑尺寸，而研究人员则根据光纤直径、光纤至组织的距离以及光纤数值孔径计算光斑尺寸。由于辐照量与光束半径的平方成反比，计算值与实测值之间的差异也可能是导致报道数值不一致的原因。尽管如此，基于本研究观察到的二极管激光器与钬钇铝石榴石激光器 H₅₀的显著差异，研究进一步探究了脉冲宽度对红外神经刺激（INS）效果的影响。
钬钇铝石榴石激光器的脉冲宽度固定为 350μs，而二极管激光器的脉冲宽度可调。为获得图 4. 中各光斑尺寸下累积分布函数（CDF）所需的辐照量范围，研究对 1875nm 二极管激光器的脉冲宽度进行了调节。在 500μm、800μm 和 1000μm 光斑尺寸下，脉冲宽度分别设置为 2ms、3ms 和 5ms。此前研究人员也已证实，在光斑尺寸恒定的条件下，脉冲宽度不会改变红外神经刺激的刺激阈值。本研究图 4. 同样表明，对于同一类型激光器，即便光斑尺寸与脉冲宽度发生改变，其 H₅₀也不受影响 (p=0.34)。为验证钬钇铝石榴石激光器效果更优并非源于更短的脉冲宽度，研究将其 H₅₀与可在 350μs 脉冲宽度下产生同等辐照量的 1470nm 二极管激光器进行对比。数据再次证实，对于 1470nm 二极管激光器，350μs 与 2ms 脉冲宽度在降低 H₅₀方面并无优势 （图 5.（a））。在图 5.（b）中，即便脉冲宽度、光斑尺寸与辐照量均相同，钬钇铝石榴石激光器的 H₅₀仍低于 1470nm 激光器。除两种激光器可为红外神经刺激提供相当的光能外，1470nm 波长的水吸收系数与 2120nm 也几乎相等（表 1.）。因此，观察到的差异不太可能源于组织内光吸收、穿透深度或产热的不同。综上，钬钇铝石榴石激光器更短的脉冲宽度并非其 H₅₀更低的原因。
尽管所有激光器的 H₅₀均不受脉冲宽度与光斑尺寸影响，但激活概率的转换程度（即 mₚₑₐₖ）会随二极管激光器脉冲宽度的减小而升高（图 6.）。图 6.（a）通过拟合相同实验条件下所有实验数据点的累积分布函数，直观呈现了这一现象。当脉冲宽度从 5ms 缩短至 350μs 时，二极管激光器对应的累积分布函数在更窄的辐照量范围内更陡峭地向激活概率 1 过渡。换言之，脉冲宽度越短，神经响应越趋近于二值化，刺激阈值也更易被识别。该转换速率可通过各累积分布函数的 mₚₑₐₖ体现 （图 6.（b））。更短脉冲宽度对应更大的 mₚₑₐₖ，说明短脉冲能更稳定地满足产生动作电位所需的温度梯度条件。该结果与研究人员此前的发现一致，研究人员证实，在 1889nm 波长下，≤2ms 的脉冲所诱发的内向电流持续时间更短、幅值更高于 10ms 脉冲。此外，尽管 10ms 脉冲能量更高 (7.3 mJ)，但≤2ms 的低能量脉冲(1.4 mJ and 2.8 mJ) 所诱发的电流幅值更大。10ms 脉冲产生的内向电流持续时间显著更长，且波形与脉冲方波相近，表明脉冲宽度对诱发去极化电流的持续时间与幅值具有关键作用。由于红外神经刺激诱发的内向电流是动作电位起始的关键，≤2ms 脉冲所诱发的持续时间更短、幅值更大的内向电流，可解释为何二极管激光器在短脉冲下能更稳定地诱发复合肌肉动作电位，以及本研究中 5ms 脉冲的 mₚₑₐₖ更小的原因。短脉冲的可靠性也可从热力学角度解释：短脉冲能更快地将红外光能量沉积于组织内，减少热扩散时间，使更多光能直接用于形成温度梯度。然而，即便在相同脉冲宽度下，钬钇铝石榴石激光器的激活概率转换曲线也始终比二极管激光器陡峭得多。
钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器会产生近乎 “全或无” 的响应，即每个脉冲要么稳定诱发复合肌肉动作电位（CMAP），要么完全不诱发。图 6.（a）体现了钬钇铝石榴石激光器的这一特征，其累积分布函数（CDF）近似阶跃函数。此外，在相同脉冲宽度下，钬钇铝石榴石激光器的 mₚₑₐₖ高于二极管激光器 [图 6.（b）]。当辐照量略高于 H₅₀时，钬钇铝石榴石激光器更陡峭的转换曲线意味着比二极管系统更可靠的刺激，能够消除刺激效果的不确定性。该现象在钬钇铝石榴石激光器的临床与实验应用中具有明确意义：相比二极管激光器，其在更低辐照量下即可实现接近 100% 的激活概率。虽然效果不及钬钇铝石榴石激光器，但中心波长接近 1450nm 的二极管激光器相比 1875nm 波段激光器，在输出功率上具有明显优势。1450nm 二极管激光器通常具备更高的输出功率，能够在更短脉冲宽度下达到所需辐照量。因此，1450nm 二极管激光器相比 1875nm 器件可获得更高的 mₚₑₐₖ，激活概率的转换曲线也更陡峭。不过，即便调节 1450nm 二极管激光器的脉冲宽度，其 mₚₑₐₖ仍无法达到钬钇铝石榴石激光器的水平。
图 3.（a）展示了 1470nm 二极管激光器与钬钇铝石榴石激光器典型的 350μs 脉冲波形。两种脉冲的积分面积相等，因此单脉冲输出能量相同。二极管激光器的波形为规整的方波，与驱动电流波形一致。与之相反，钬钇铝石榴石激光脉冲呈非对称形态，在脉冲起始处存在约 1μs 的尖峰。该脉冲形状由闪光灯泵浦方式所致，与二极管依靠驱动电流输出的方式不同。由于该尖峰可产生更高的峰值功率，研究探究了其对钬钇铝石榴石激光刺激效果的影响。遗憾的是，受限于二极管的上升沿特性，该类激光器无法生成相似的脉冲波形。因此，研究转而探究去除钬钇铝石榴石脉冲尖峰后的效果。使用无尖峰钬钇铝石榴石脉冲的实验结果显示，其 H₅₀与 1470nm 二极管激光器 350μs 脉冲的结果基本一致 （图 7.（a））。此外，无尖峰脉冲的 H₅₀显著高于原始钬钇铝石榴石脉冲。去除微秒级尖峰后，钬钇铝石榴石激光器的 mₚₑₐₖ同样下降，结果更接近二极管激光器。综上，无尖峰钬钇铝石榴石脉冲与二极管脉冲的 mₚₑₐₖ均显著低于原始钬钇铝石榴石脉冲 （图 7.（c））。上述结果表明，钬钇铝石榴石脉冲起始处的微秒级尖峰，是其刺激效果优于二极管激光器的主要原因。
数据显示，钬钇铝石榴石激光器更低的 H₅₀与更高的 mₚₑₐₖ，可能源于脉冲起始高强度尖峰带来的快速能量沉积。该结论与研究人员此前的研究结果高度吻合。研究人员采用 1937nm 二极管激光器证实，在沙土鼠耳蜗中诱发复合动作电位（CAP）的刺激阈值会随脉冲宽度缩短而降低。有趣的是，研究人员同样发现，脉冲宽度从 300μs 降至 100μs 时刺激阈值显著下降，并持续降低至 5μs。在另一项研究中，研究人员使用 1860nm 二极管激光器在沙土鼠耳蜗中观察到相同趋势，发现在 100～1000μs 脉冲宽度范围内，刺激阈值对应的峰值功率保持恒定，而当脉冲宽度≤35μs 时则有所上升。带有前沿微秒尖峰的钬钇铝石榴石脉冲，可能产生与研究人员观测结果相似的效应，即形成更高峰值功率，进而如同 < 100μs 脉冲一样降低刺激阈值。该效应同样可归因于高峰值功率更稳定地构建出红外神经刺激（INS）所需的温度梯度。此外，根据研究数据，研究人员认为光学作用靶点的热弛豫时间约为 30～100μs。因此，对于钬钇铝石榴石脉冲中微秒级尖峰这类短脉冲，脉冲内的光能可在热量有充足时间耗散前便沉积于神经组织，快速形成所需温升。鉴于听觉系统中红外神经刺激机制仍存在争议，需要说明的是，研究人员并未使用耳聋动物模型，且光声或热膨胀模型与耳蜗内刺激所需的最小功率相符，尽管所用脉冲时长并不满足该波长下的应力约束条件。
上述研究结果同样为光吸收剂诱导神经热刺激（PAINTS）相关研究提供了补充。与红外神经刺激（INS）类似，光吸收剂诱导神经热刺激借助外源性生色团吸收实现光热神经刺激，从而在靶向更深层神经结构时具备更高的灵活性。在大鼠脑切片培养实验中，研究人员采用 800nm 钛蓝宝石激光器证实，大鼠脑切片的刺激阈值随脉冲宽度缩短而降低，并在 50μs 左右趋于稳定。此外，纯热刺激阈值曲线无法预测这类短刺激脉冲的实验结果，提示存在非热辅助机制。研究人员推测该辅助机制本质上可能为光机械效应，因为微秒级脉冲相比毫秒级脉冲更易诱发瞬时压力波。本研究所得数据为这一假说提供了有力支持。
如前所述，研究人员证实，能量较低的≤2ms 脉冲所诱发的内向电流，持续时间更短、幅值更高于能量更高的 10ms 脉冲。结合本研究数据并假设该趋势成立，已有充足证据表明，钬钇铝石榴石（Ho:YAG）脉冲起始的微秒级尖峰，是其刺激具有更低 H₅₀且激活概率转换更陡峭的原因。此外，若将该尖峰与脉冲其余部分独立分析，微秒级脉冲相比本研究中其他脉冲时长更接近应力约束状态。尽管本研究未提供实验证据，但钬钇铝石榴石激光刺激过程中可能存在微弱光机械效应，因为光机械效应与光热效应难以完全分离。因此，钬钇铝石榴石激光诱发动作电位的机制，可能与研究人员提出的通用红外神经刺激机制一致，即通过部分由光机械驱动、而非单纯光热驱动的电容变化实现。需要注意的是，本研究与研究人员的实验采用了差异显著的实验装置。
在红外神经刺激的临床转化方面，标准与无尖峰钬钇铝石榴石激光实验数据表明，微秒级时长的低能量短脉冲可能为红外神经刺激提供更可靠的方案。该微秒级尖峰仅占总脉冲能量的 8%~11%，却对刺激效果产生显著影响。若红外神经刺激仅需短程低能量脉冲，该技术在临床应用中将具备极大优势，因为更低的能量可进一步降低激光诱导损伤的风险。但截至本文撰写，尚无兼具成本效益、可在合适波长下输出低能量短脉冲组合的激光光源。尽管未纳入本研究范畴，但使用准直光束同样具有实际临床意义。辐照量与入射至组织的光束半径平方成反比，使用裸露光纤时，入射光斑尺寸取决于光纤输出端至组织的距离。因此在手持式探头操作中，临床操作中常见的光纤与组织间距微小变化，均会显著改变辐照量。准直光束可在较大距离范围内保持光斑尺寸恒定，使多次光纤放置或调整过程中的辐照量保持稳定。
最后，本研究首次证实了 1450nm 激光用于红外神经刺激（INS）的急性组织学安全性（图 8.）。研究采用与既往研究相似的二分类评分标准对组织切片进行评估，损伤指征包括神经纤维髓鞘颗粒样破坏与空泡化、轴突损伤、炭化以及消融坑形成。在 3 倍 H₅₀的辐照量（约 3J/cm∧（2））下，1450nm 与 1875nm 二极管激光器均未出现髓鞘破坏或炭化迹象 （图 8.（c）、图 8.（d）。当辐照量大于 3J/cm∧（2）时可观察到髓鞘损伤。因此，两种二极管激光器表现相近，安全比率均约为 3:1。本研究确定的安全比率与钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的急性安全比率相近，后者已在既往研究中得到充分验证。这一结果证实，尽管 1450nm 与 1875nm 二极管激光器相比效果更优的钬钇铝石榴石激光器具有更高的 H₅₀与更低的 mₚₑₐₖ，但其仍可安全应用于红外神经刺激。
综上，上述结果证实红外神经刺激能够有效且安全地诱发大鼠坐骨神经的神经活动。本研究数据验证了既往关于脉冲时长与刺激阈值关系的结论，同时表明 1450nm 激光二极管相比 1875nm 二极管更适合作为红外神经刺激的光源。
尽管钬钇铝石榴石激光器具有诸多优势，短波红外（SWIR）二极管激光器仍是一种高效、低成本且操作简便的红外神经刺激手段。本研究结果为优化二极管激光器的红外神经刺激效果提供了重要参考。虽然二极管激光器的 H₅₀不受脉冲宽度影响，但缩短脉冲宽度可提升激活概率的转换速率，从而实现更稳定的刺激。使用中心波长接近 1450nm 的激光二极管尤其易于实现短脉冲红外神经刺激，因为相比 1875nm 二极管，其能够在更短脉冲宽度下达到足够的辐照量。光斑尺寸对红外神经刺激效果几乎无影响，但会以牺牲空间选择性为代价。本研究首次从组织学层面证实，1450nm 与 1875nm 波长具有相近的损伤阈值与安全比率。二极管激光器的安全比率为 3:1，高于钬钇铝石榴石激光器 2:1 的安全比率。本研究已证实 1450nm 与 1875nm 二极管激光器作为红外神经刺激光源效果基本相当，而 1450nm 二极管商业化应用更广泛且输出功率更高，可借此提升红外神经刺激在实验与临床场景中的可及性与适用性。
五、结论本研究表明，1450nm 二极管激光器可作为红外神经刺激（INS）的有效且安全的激光光源，其效果与应用更为广泛的 1875nm 二极管激光器相当。研究证实，钬钇铝石榴石（Ho:YAG）激光器的刺激效果优于二极管激光器，主要原因是其脉冲起始处存在初始尖峰。尽管钬钇铝石榴石激光器性能优于二极管激光系统，但二极管激光器仍是红外神经刺激中兼具成本效益与可靠性的激光光源。本研究结果还为优化二极管激光器的红外神经刺激性能提供了简便可行的方案。展望未来，紧凑型真脉冲激光器将成为临床红外神经刺激的理想激光系统。而 1450nm 二极管激光系统则为探索红外神经刺激方案提供了最优的折中选择。综上，本研究结果为改进红外神经刺激技术及其激光光源，推动其作为无标记神经调控工具的应用提供了新思路。
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